コンピテントセル作成

１．種菌をLB plateにストリーク(O/N)…①

２．コロニー２,３個をつつき、数ml(3～5ml)のLBで振盪培養(5時間程度)…②

３．コンピテントセル培養溶液*で振盪培養(18℃、O/N～2日)…③

分光光度計で菌の濃度を確かめ、OD600＝0.4～0.8に達するまで培養

※TOP10株はDH5α株よりも増殖がはやいので注意すること。

４．培養後の遠心～凍結までの操作

・ フラスコの中身を50mlチューブ数本に移して遠心(４℃、4000rpm、10min)

・ 氷上で冷却した(ice-cold)6mlのTB buffer*に懸濁し、再度遠心(4℃、4000rpm、10min)

・ 7％のDMSOを含むice-cold TB bufferに懸濁する

・ 氷上に置いたエッペンチューブ分注し、－80℃で保存する(可能であれば液体窒素で凍らすとよい)。

※培養後の操作は必ず氷上で行う。

※分注はできるだけ素早く行う。数人でできる場合は、操作を手分けして行うとよい

コンピテントセル培養溶液(200～300ml)

LB粉末

glucose(20mM)

MgSO₄(20mM)

ビーカー等でDWにグルコースとMgSO₄を溶かし濃度を調整する。

規定量のLB粉末を溶かす。

TB buffer

PIPES (10mM)

CaCl₂ (15mM)

KCｌ (250mM)

MnCl₂ (55mM)

1．MnCl₂以外の試薬をDWに溶かしてpH6.7に調整する。

2．MnCl₂を加えた後、メスアップして目的の量に調整する。

※pH調整前にMnCl₂を加えると、調整時にMnが析出してしまう

3．2の溶液をフィルター滅菌する…冷蔵庫で保存

当方では今のところ上記の方法で上手くいってますが、この方法で上手くいかなくてもクレームは受け付けませんよ。大腸菌がちゃんと増殖曲線に乗っているくらいの元気なうちに〆るのを心がければだいたいOKなはずです。あ、継代するうちにコンピテンシーが下がることもあるようです。そうなったら買い替えましょう。